AAT Bioquest pH荧光探针Protonex 500-PEG12，SE 货号21219

氨基反应性 Protonex Green 500 SE (#21216) 专为制备 Protonex Green 500 缀合物作为荧光 pH 探针而开发。然而，Protonex Green 500 SE 的实用性因其溶解性差而受到限制。 Protonex Green 500-PEG12 SE (#21219) 的开发目的是改善 Protonex™ Green 500 SE (#21216) 的不良溶解度，同时保持 Protonex Green 500 优异的光谱和 pH 特性。它们具有相同的光谱和 pH 值，但Green 500-PEG12 的溶解度提高。 Protonex Green 500 染料表现出 pH 依赖性荧光。与大多数现有荧光染料在较高 pH 条件下发出强的荧光不同，酸性条件增强了 Protonex  Green 500 染料的荧光，使其成为出色的嗜酸荧光探针。随着 pH 从中性降至酸性，Protonex Green 500 染料的荧光增强。由于细胞外缺乏荧光，因此清洗步骤。 Protonex Green 染料提供了监测酸性细胞区室（例如内体和溶酶体）的强大工具。 Protonex 染料在细胞外不发出荧光，但在酸性区室（例如吞噬体、溶酶体和内体）中发出明亮的荧光。该 Protonex Green 能够特异性检测细胞酸性区室，减少信号变异性并提高成像或流式应用的准确性。 Protonex Green 具有与 FITC 相似的光谱特性，使得 FITC 的通用滤光片组可轻松用于 Protonex Green 的测定。

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AAT Bioquest pH荧光探针Protonex 500-PEG12，SE 货号21219溶解方案(溶剂以说明书为准)

实验方案

储备溶液配制

除非另有说明，所有未使用的储备溶液应分成一次性等份，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环。

蛋白质储备液（溶液A）

将 100 µL 反应缓冲液（例如，pH 值 ~9.0 的 1 M 碳酸钠溶液或 1 M 磷酸盐缓冲液）与 900 µL 目标蛋白溶液（例如，抗体、蛋白浓度 > 2 mg/mL（如果可能））混合，得到1 mL 蛋白质标记储备液。

注意：蛋白质溶液（溶液 A）的 pH 应为 8.5 ± 0.5。如果蛋白质溶液的 pH 值 8.0，请使用 1 M 碳酸氢钠溶液或 1 M pH 9.0 磷酸盐缓冲液将 pH 值调节至 8.0-9.0 范围。

注意：蛋白质应溶解在 1X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)（pH 7.2-7.4）中。如果蛋白质溶解在 Tris 或甘氨酸缓冲液中，则用 1X PBS（pH 7.2-7.4）进行透析，去除用于蛋白质沉淀的游离胺或铵盐（例如铵和醋酸铵）。

注意：不纯的抗体或用牛白蛋白 (BSA) 或明胶稳定的抗体标记效果不好。或硫柳的存在也可能干扰缀合反应。或硫柳可通过透析或旋转柱去除，以获得标记结果。

注意：如果蛋白质浓度 2 mg/mL，结合效率会降低。为了获得标记效率，建议终蛋白质浓度范围为 2-10 mg/mL。

Protonex Green 500-PEG12，SE 储备溶液（溶液 B）

将无水 DMSO 添加到 Protonex Green 500-PEG12, SE 的小瓶中，制成 10 mM 储备溶液。通过移液或涡旋充分混合。

注意：在开始缀合之前准备染料储备溶液（溶液 B）。请及时使用，延长储存染料原液可能会降低染料活性。避光防潮时，溶液 B 可在冰箱中保存两周。避免冻融循环。

操作步骤

该标记方案是为山羊抗小鼠 IgG 与 Protonex Green 500-PEG12, SE 的缀合物而开发的。仅供参考。

注意：每种蛋白质都需要不同的染料/蛋白质比例，这也取决于染料的特性。蛋白质的过度标记可能会对其结合亲和力产生不利影响，而低染料/蛋白质比率的蛋白质缀合物会降低灵敏度。

1.运行缀合反应

1.1使用摩尔比为 10:1 的溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）作为起点：将 5 µL 染料储备溶液（溶液 B，设染料储备溶液为 10 mM）添加到小瓶中有效摇动的蛋白质溶液（95 µL 溶液 A）。设蛋白质浓度为 10 mg/mL，蛋白质的分子量为 ~200KD，则蛋白质浓度为 ~0.05 mM。

注意：我们建议使用溶液 B（染料）/溶液 A（蛋白质）摩尔比为 10:1 的溶液。如果太低或太高，则分别确定染料/蛋白质比例为 5:1、15:1 和 20:1。

1.2继续在室温下旋转或摇动反应混合物30-60分钟。

2.纯化

以下方案是使用 Sephadex G-25 柱纯化染料-蛋白质缀合物的示例。

2.1根据说明准备 Sephadex G-25 柱。

2.2将反应混合物（来自“进行缀合反应”）加载到 Sephadex G-25 柱的部。

2.3当样品刚好流到部树脂表面下方时，立即添加 PBS（pH 7.2-7.4）。

2.4向所需样品中添加多 PBS (pH 7.2-7.4) 以完成柱纯化。合并含有所需染料-蛋白质缀合物（注：柱式纯化后的样品，会根据成分不同分出多个，请检查出哪些包含了我们需要的荧光素标记蛋白产物，将所有包含该目标产物的分数给取出来集中在一起。）。

注意：为了立即使用，染料-蛋白质缀合物需要用染色缓冲液稀释，并等分多次使用。

注意：为了长期保存，染料-蛋白质缀合物溶液需要浓缩或冷冻干燥。