AAT Bioquest MitoROS Brite 570 针对线粒体中的活性氧 ROS 检测进行了优化货号15998

线粒体 ROS（mtROS 或 mROS）是线粒体中产生的活性氧 (ROS)。 mtROS 的选择性检测是研究线粒体细胞功能的一项任务。细胞渗透性 MitoROS Brite™ 570 试剂具有细胞渗透性，并选择性定位于线粒体中。它是非荧光的，并在线粒体中的 ROS 氧化时产生明亮的橙色荧光。可以使用荧光成像、高内涵成像、微孔板荧光测定法或流式细胞术来测量产生的荧光。 mtROS被认为是细胞代谢的副产物。然而，它们现在被认为是重要的信号分子。 mtROS 主要是在线粒体内膜上电子传递链 (ETC) 的氧化磷酸化过程中形成的。电子从配合物 I 和 III 中泄漏，部分还原氧形成氧化物。氧化物通过两种歧化酶快速转化为：线粒体基质中的 SOD2 和膜间隙中的 SOD1。在低水平下，mtROS 对于代谢适应（例如缺氧）至关重要。它们调节由危险信号引发的炎症反应。高 mtROS 水平会细胞凋亡和自噬途径，可能诱导细胞死亡。线粒体功能障碍导致活性氧水平升高，从而导致衰老。 mtROS 会诱导细胞衰老，这是一种应激反应。近有报道称，COVID-19患者肺部的单核细胞/巨噬细胞会产生mtROS，影响疾病的致病性，因此靶向mtROS可能成为抗冠状病毒新药的策略。

使用MitoROS 570分析方案

使用前，在室温下解冻 MitoROS Brite 570。解冻后，短暂离心以收集干燥的沉淀。

概述

在生长培养基中准备细胞。

使用 MitoROS Brite 570 工作溶液对细胞进行染色。

用所需的测试化合物处理细胞。

使用 Cy3 滤光片组或 Ex/Em = 540/590 nm 监测荧光强度。

溶液配制

除非另有说明，所有未使用的储备溶液应分成一次性等份，并在制备后储存在-20°C。避免反复冻融循环

1）MitoROS 570 原液配制

在 DMSO 中制备 5 至 10 mM MitoROS Brite 570原液。

注意：制备一次性等份的 MitoROS Brite 570 原液并储存在 ≤ -20°C 下，避光。避免冻融循环。

2）MitoROS 570 工作溶液配制

用HHBS稀释MitoROS Brite 570 原液，制备 5 至 10 μM MitoROS Brite 570 工作溶液。

注意：为了获得效果，请在制备后几小时内使用该溶液。

注意：用箔纸覆盖工作溶液或将其存放在黑暗的地方，以避光。

操作步骤

1.根据需要将细胞铺在 96 孔黑色透明底板中。

2.将 100 µL MitoROS Brite 570 工作溶液添加到细胞中。

3.将细胞在 37°C 避光条件下孵育 30 至 60 分钟。

注意：MitoROS Brite 570 的浓度和孵育时间可能因不同细胞系而异。您可能需要测试不同的浓度以确定条件。

4.除去染料工作溶液并用 HHBS 缓冲液洗涤细胞两次。

5.根据需要处理细胞。

6.去除处理并用 HHBS 缓冲液洗涤细胞两次。

7.添加 HHBS 缓冲液并使用带有 Cy3 滤光片组的荧光显微镜检测细胞荧光。

AAT Bioquest MitoROS Brite 570 *针对线粒体中的活性氧 (ROS) 检测进行了优化*货号15998参考文献