一、百萤 Annexin V-Cy5标记简介和工作原理
细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。 在正常细胞中，磷脂酰丝酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS 从而将这些程序性死亡的细胞，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。 AnnexinⅤ是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。PS 外翻发生在细胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得Annexin V 与PS 的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。
二、百萤 Annexin V-Cy5标记实验方案及适用仪器分析
实验方案
概述
用测试化合物（200μL/样品）制备细胞
添加Annexin V结合物测定溶液
室温孵育30-60分钟
用流式细胞仪或荧光显微镜分析
1.用膜联蛋白V缀合物制备和孵育细胞：
1.1制备膜联蛋白V结合测定缓冲液：10mM HEPES，140mM l和2.5mM CaCl2，pH 7.4。
1.2用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。
1.3离心细胞，得到1-5×105个细胞/管。
1.4将细胞重悬于200μL膜联蛋白V结合测定缓冲液中（来自步骤1.1）。
1.5在细胞中加入2μL膜联蛋白V结合物。
可选：在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭，用于坏死细胞。
1.6在室温下孵育30至60分钟，避光。
1.7在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μL膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）以增加体积（参见下面的步骤1.8）。
1.8使用流式细胞仪或荧光显微镜监测荧光强度（参见下面的步骤2或3）。
适用仪器分析
2.使用流式细胞仪分析：
通过使用具有适当过滤器的流式细胞仪来量化膜联蛋白V缀合物。
注意：粘附细胞上的膜联蛋白V结合流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。 然而，Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。 和van Engelend等人（见参考文献1和2）。
3.使用荧光显微镜分析：
3.1移取步骤1.6的细胞悬液，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，然后用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）重悬细胞。 将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。
注意：对于粘附细胞，建议直接在盖玻片上生长细胞。 与膜联蛋白V缀合物孵育（步骤1.6）后，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，并将膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。 在与膜联蛋白V缀合物孵育后，细胞也可以在2％甲醛中固定，并在显微镜下观察。
3.2在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白V缀合物的凋亡细胞