百萤Annexin V-mFluor Violet 540标记实验方案

一、百萤Annexin V-mFluor Violet 540标记概述

百萤Annexin V-mFluor Violet 540标记探针用于检测细胞功能的探针膜联蛋白是在钙存在下与磷脂膜结合的蛋白质家族。Annexin V 是研究细胞凋亡的重要工具。它用作检测在细胞表面表达磷脂酰丝酸的细胞的探针，这是在细胞凋亡和其他形式的细胞死亡中发现的特征。有多种参数可用于监测细胞活力。Annexin V 染料偶联物广泛用于通过测量磷脂酰丝酸 (PS) 的易位来监测细胞凋亡。在细胞凋亡中，PS 被转移到质膜的外层。细胞表面磷脂酰丝酸的出现是细胞凋亡初期/中期的普遍指标，可以在观察到形态学变化之前检测到。这种荧光膜联蛋白 V 结合物具有类似于 Pacific Orange®（Pacific Orange® 是 Invitrogen 的商标）的光谱特性。橙色荧光染色在 405 nm 的紫色激光下很好地激发，并在 ~560 nm 发出强烈的蓝色荧光。

二、百萤Annexin V-mFluor Violet 540实验方案

分析方案

概述

用测试化合物（200μL/样品）制备细胞

添加Annexin V结合物测定溶液

室温孵育30-60分钟

用流式细胞仪或荧光显微镜分析

1.用膜联蛋白V缀合物制备和孵育细胞：

1.1制备膜联蛋白V结合测定缓冲液：10mM HEPES，140mM l和2.5mM CaCl2，pH 7.4。

1.2用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。

1.3离心细胞，得到1-5×105个细胞/管。

1.4将细胞重悬于200μL膜联蛋白V结合测定缓冲液中（来自步骤1.1）。

1.5在细胞中加入2μL膜联蛋白V结合物。

可选：在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭，用于坏死细胞。

1.6在室温下孵育30至60分钟，避光。

1.7在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μL膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）以增加体积（参见下面的步骤1.8）。

1.8使用流式细胞仪或荧光显微镜监测荧光强度（参见下面的步骤2或3）。

2.使用流式细胞仪分析：

通过使用具有适当过滤器的流式细胞仪来量化膜联蛋白V缀合物。

注意：粘附细胞上的膜联蛋白V结合流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。 然而，Casiola-Rosen等人先前报道了利用膜联蛋白V对贴壁细胞类型进行流式细胞术的方法。 和van Engelend等人（见参考文献1和2）。

3.使用荧光显微镜分析：

3.1移取步骤1.6的细胞悬液，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，然后用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）重悬细胞。 将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。

注意：对于粘附细胞，建议直接在盖玻片上生长细胞。 与膜联蛋白V缀合物孵育（步骤1.6）后，用膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，并将膜联蛋白V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）加回到盖玻片中。 在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。 在与膜联蛋白V缀合物孵育后，细胞也可以在2％甲醛中固定，并在显微镜下观察。

3.2在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白V缀合物的凋亡细胞

三、百萤Annexin V-mFluor Violet 540标记光谱特性